产品目录

本试剂盒采用了世界先进的定向拓扑异构酶克隆技术可以在5分钟内将待表达目的基因（高保真酶扩增的平末端片段）一步法定向克隆到Gateway入门载体（entry vector），得到的入门克隆（entry clone）可以和各种Gateway目的载体（destination vector）通过LR重组反应，生成表达克隆（expression clone）。方便目的基因在原核/哺乳动物细胞/酵母/昆虫表达系统切换表达。

• 简单快速，加入待表达基因片段室温仅需5分钟便可完成入门克隆构建。
  
• 定向克隆技术，超过90%插入为正确方向插入，减少克隆筛选耗费的时间。
  
• 本载体不含原核表达Shine-Dalgarno（SD)序列，因此构建原核表达克隆时应选择带SD序列的目的载体进行LR重组。也可在设计的时候，在目的片段前自带SD序列。

• 待表达目的基因扩增引物设计原则：
  
  • 为了达到定向克隆的目的，上游引物5’端应该加上额外的4个碱基CACC，这样PCR产物的5'端可以和载体上突出的GTGG互补配对，从而达到定向克隆的目的。举例：
    待表达序列：5'-ATG GGA TCT GAT AAA...
    设计上游引物：5'-CACC ATG GGA TCT GAT AAA...
    
  • 如果不计划和载体C端融合表达，则下游引物的起始端应该加上终止密码子（密码子序列应该为反向互补序列，例如终止密码子是TGA，那么下游引物起始为TCA）
    
  • 如计划和载体C端融合表达，则下游引物的起始端应该不包含终止密码子；为达到定向克隆的目的，下游引物5'起始应该不包含CACC，这样可以避免PCR产物的3'端也可以和载体上突出的GTGG互补配对而造成错误方向的插入。
• 连接反应的准备：
  PCR引物不能磷酸化。使用扩增产物是平末端的高保真聚合酶系列扩增（如Pfu、Vent、Kod、Phusion DNA Polymerase）。PCR产物建议胶回收纯化（货号：ALH096)。
  
• 连接反应：
  
  • 室温（20℃～30℃）按照如下体系操作（10μL体系）：
    

    成分	用量
    纯化后的PCR产物	0.5～8μL
    pTOPO-ENTR/D Vector	1μL
    10×Enhancer	1μL
    灭菌水	X μL
    总体积	10μL

    
    加完试剂后，用移液器轻轻吹打混匀或者轻弹管底混匀，低速瞬时离心收集所有液体在离心管底，注意此步骤不能在冰上进行，只能在室温（20～30℃）进行。
    不同大小插入片段的推荐用量：
    

    插入片段大小(bp)	最佳用量(ng)
    100-1000	20-40
    1000-2000	30-70
    2000-5000	40-100

    
    
  • 室温（20℃～30℃）连接5分钟。
    本载体推荐室温5分钟完成连接，但在很多情况下连接2～3分钟已经可以得到足够多的转化子。
    
  • 连接产物可直接转化克隆感受态细胞（如DH5a，TOP10等）或贮存于-20℃。
    如尚未准备好感受态细胞，可以将连接产物短时间置于冰上备用。
• 转化：
  
  • 50～100μL感受态细胞，置于室温解冻，完全解冻后（约1分钟左右）轻掸几次将细胞均匀悬浮。
    
  • 加入5μL连接液(最多可全部加入，只要体积不超过感受态细胞体积的1/10)，轻轻混匀，室温放置5分钟。
    根据我们的经验，本公司载体使用商品化的感受态细胞不需要冰浴和热休克、室温放置5分钟便可获得足够多转化子，如果实验室自制感受态细胞或者效率较低时，可以按照标准程序进行。
    
  • 加300～500μL LB或者SOC培养基(不含抗生素)，37℃ 180rpm振荡培养60分钟。
    根据我们的经验，一般可以直接将培养基（事先平衡至室温）加入感受态细胞的1.5mL离心管，盖上离心管盖，水平固定在振荡培养箱中振荡培养复苏即可，不需要转移到试管培养复苏。
    
  • 取200μL菌液涂板，培养过夜（如果预计转化子少，为得到较多克隆，4000rpm离心1min，吸弃掉部分上清，保留100～150μL，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板）。
• 转化子的筛选鉴定：
  
  • 菌落PCR检测/提取质粒内切酶酶切鉴定阳性克隆。
    
  • 用M13通用引物测序，来确定是否含有目的克隆。

• pTOPO-ENTR/D载体图谱：
  
  
• pTOPO-ENTR/D载体通用测序引物序列：
  M13F:CTGTAAAACGACGGCCAG
  M13R:CAGGAAACAGCTATGAC
  
• pTOPO-ENTR/D载体克隆位点序列：